Q.

Jeg husker det som om det var i gar. Jeg var i en medarbeiderlaboratorium som l rte en ny protokoll og trengte a kjore en bekreftende Western blot for de fortsatte. «Ikke noe problem,» sa jeg, «jeg har kjort tusenvis. Bare pek pa meg i den riktige retningen, og jeg vil ikke plage deg en bit. «Haha- kom igjen, Amy – det er en million mater a kjore en Western blott, og hvert laboratorium gjor det annerledes.

Faktisk, fordi jeg vet at dette er sant, skrev jeg en syv-siders protokoll for laboratoriet vart for a effektivisere Western blotting-prosessen. Her smiler jeg den protokollen ned til lengden pa et blogginnlegg ved a peke pa essensielle og noen tips og triks. Dette er ikke ment a v re en omfattende protokoll, men mer en referanse for nylig innledte medlemmer av Western blot-samfunnet.

Velg riktig prosentandel gel. (Enten du lager gelen alene eller bruker en pre-gele, dette er nokkelen). Hvis proteinet av interesse har hoy molekylvekt, er en lavere prosentandel gel det beste valget. Hvis proteinet av interesse har lav molekylvekt, er en hoyere prosentandel gel det beste valget. Merk: Du kan ogsa se pa nettet for a se hvordan proteiner med forskjellige molekylvekter vil skille avhengig av hvilken type gel og lopebuffer som brukes. Precast gel notat: Fjern eventuelle klistremerker som sier «Fjern for bruk.» Forbered lopebuffer. Merk: Det er best a lage og bruke frisk hvis du kan. Det er sa mange steder for feil i Western blotting og starter med a kjore buffer som er stinkende eller utarmet av noe viktig, ville v re super trist! Fyll tanken din. Jeg vet, du kan kjore din gel raskere med mindre buffer, men du kan ogsa smelte den. (Smiling Western blot-band, noen?) Legg din stige og prover. Vortex, hvirvel, vortex – med mindre du vil at proteinkonsentrasjonene skal v re av, fordi provene avgjores. Hvis du har tomme bronner i gelen din, fyll dem med litt fargestoff – dette vil hjelpe gelen til a kjore rett og vil ogsa motvirke de smilende bandene. Merk: Hvis du skal kutte de resulterende membranene vertikalt for a teste mer enn ett sett med prover, er standarder og stiger gode mater a skille settene og for a opprettholde riktig orientering av provene dine. Kjor gelen. Hvert system er annerledes – ta kontakt med interwebs for optimal spenning, tid og temperatur for a kjore gelen basert pa buffere og utstyr som brukes. (For eksempel, bor du kjore det over natten i kaldt rom ved lav spenning eller ved romtemperatur i et par timer?) Ahhh, vi har kommet til en av disse trinnene: Onsker du a fa resultatene ASAP? Trenger du a gjore massevis av andre ting og vil helst sette det og glemme det? Du kan ogsa ta dette i betraktning. Hvis du konsekvent fyller tanken din til «full» -linjen, kan du bestemme den eksakte spenningstiden det vil ta for a kjore fargestoffet til hoyre til bunnen av gelen hver gang. Dette sikrer god adskillelse av proteinene dine, at verken dine prover eller molekylvektstandardene dine er forsvunnet i avgrunnen, og at du enkelt kan overfore protokollen til andre: «Bare kjor den pa ______ for _______.» Forbered deg pa overforing. Alle membraner er ikke skapt like! Velg riktig membran for eksperimentet-PVDF eller nitrocellulose? Hvilken storrelse porer? Ring en venn, spor en annen labmedlem eller konsulter internett for det beste alternativet basert pa protein av interesse – spesielt hvis det er gigantisk eller teeny lite (eller hvis laboratoriet har en rekke forskjellige membrantyper som ligger rundt). Aktiver membranene dine om nodvendig – det tar sekunder, men er super viktig. Tips: Jeg kutter overste venstre hjorne av hver membran pa en diagonal for alltid a holde orientering. Merk: Ikke ror membranen med fingrene – selv om du har pa deg hansker! Finn, stjele, bestil, (uansett) deg selv, et fint par flatharte pinsetter for a bruke for dette, i stedet. Bygg din «overforingssmorbrod». Fjern gelkassetten fra tanken og skille kassetten til a utsett gelen. Tips: Tanker har en merkelig form pa dekslene og gelene har et spor over dem slik at du enkelt kan knuse plasten uten a rippe gelen din. Bygg din «transfer sandwich». Fem ar i er jeg sikker pa at jeg alltid bygger min sandwich i riktig rekkefolge, men dette var ikke alltid tilfelle. Aftera few «Hvor i helvete gikk proteinene mine!» Oyeblikk, laget jeg min lille skjematiske. Dette er for vart torre overforingsapparat, men du far bildet. Det lindrer ogsa massevis av sporsmal fra nye brukere, andre gjetter deres bygg. V r forsiktig, men fast nar du lager ditt mesterverk – sa be for ingen bobler! Velg overforingstider og spenninger. Du bor overfore proteiner med lav molekylvekt for mindre tid eller ved lavere spenning, slik at proteinene dine ikke gar gjennom membranen. Proteiner med hoyere molekylvekt kan overfore i lengre tid eller ved hoyere spenning for a gi dem tid til a migrere inn i membranen. Spenningstiden for overforinger vil variere ut fra ditt valg av buffere, membraner, utstyr (vat mot torr overforing) og temperatur. Igjen er nettsiden til din favoritt Western blot-firma nyttig her. Og enda et sted for a bestemme om det skal fortsette a bevege seg fremover eller ta en pause ved a overfore natten … Blokker din membran. Det er best a sjekke med firmaet som utviklet antistoffet for de optimale forholdene, men her er noen blokker jeg har mott: 5 minutter i metanol ved romtemperatur etterfulgt av a la membranen torke helt (noe som betyr at du kan torke over natten hvis du trenger det a ga ut for dagen). 1 time i 5% fettfri torr melk (NFDM) eller 5% BSA i PBS eller TBS. 1 time i membranblokkerende losning (vanligvis selskapets kodenavn for noen type serum). Forbered antistoffene. Jeg har alltid blitt l rt a forberede antistoffene i hvilken losning du har blokkert. Det kan imidlertid variere basert pa blokkeringslosningen. For eksempel kan du v re bedre a fortynne antistoffet i 2% i stedet for 5% NFDM. Prim r antistoff: Kontakt utviklerens nettsted for et utvanningsomrade for a starte. Rundt 1: 1000 er en god innsats hvis du ikke har et solid utgangspunkt – med mindre du har et lavt niva mal. Inkuber over natten pa en shaker i et kaldrom, eller inkuber i 1-4 timer pa en rister ved romtemperatur. Ak, et annet potensielt stoppested. Sekund rt antistoff: En 1: 5000 eller 1: 10.000 fortynning synes a v re standard for HRP-koblede sekund re. Dette vil avvike hvis du bruker fluorescens-konjugerte sekund rer – spor Google! Kryss fingrene og t rne, og tenk positive tanker!

Mens Western blots er en super vanlig laboratorieteknikk, er det mange steder hvor de kan ga galt. A utarbeide en standardprotokoll for proteiner av interesse og antistoffer som oftest brukes i laboratoriet ditt, kan eliminere mye hubbub; sa ogsa kan en palitelig feilsokingsveiledning for nar disse blutene er skitne, tomme, lopende skra eller smilende. Jubel!

Quartzy er verdens nr. 1 laboratoriestyringsplattform. Vi hjelper forskere med a organisere ordrer, administrere inventar og spare penger. Vi er gratis og vil alltid v re. Besok Quartzy.com eller na ut pa [email protected]

Dele denne:

Amy M Palubinsky.

Amy Palubinsky er en doktorand for nevrovitenskap ved Vanderbilt University og mor til to menneskelige barn og en pelsjente. Hun hater morgen og elsker derfor kaffe.

L r om oss.

PARTNER MED OSS.

LOVLIG.

© 2017 Quartzy Inc. Alle rettigheter reservert.

Excel® er et registrert varemerke for Microsoft Corporation. Quartzy er ikke knyttet til Microsoft Corporation.


Vil du spille i det mest ærlige kasinoet? Vi forbereder det for deg. Prøv her nå!